2008-11-30

[轉載] 血管新生與神經病變

台大醫學院 謝豐舟教授

  腦部血管病變是相當常見的疾病,血管病變所致的死亡人數中,腦僅次於心臟,而且腦血管病變所致的後遺症相當嚴重,經常導致殘障。一旦缺乏血流供應,腦細胞迅速死亡,殘存的細胞通常不足以維持正常功能。因此瞭解在發育及疾病過程之中,腦與其血管的密切關係就變得十分重要。

  由於近幾年來,血管新生與神經疾病分子機轉的相關研究進展快速,因此探究腦的血管新生與神經疾病的關連正是時候。在神經病變的過程中,血管新生(angiogenesis)與神經細胞新生(neurogenesis)兩者都相當明顯。在血管新生、神經細胞新生與神經病變三者之間,VEGF(vascular endothelial growth factor,血管內皮生長因子)扮演了關鍵性的角色。VEGF最初發現於血管系統,其相關的訊息傳遞也已清楚。近幾年來VEGF在神經系統的角色日漸顯著。從它在stroke及motor neuron disease等神經病變的角色來看,VEGF及其下游的訊息傳遞可能是這些疾病具有厚望的治療標的。

腦的血管新生

  中樞神經系統經由血管新生(angiogenesis)的過程獲得其血流供應系統,也就是由原有血管,萌生出新的微血管,再形成血管網絡。另一血管形成方式-vasculogenesis,即由先驅細胞長成血管,並未見於中樞神經系統。

  在胚胎發育的早期,血管由軟腦膜(pia mater)侵入腦組織,並且向腦室集中。某些穿透較深的血管到達腦室周圍並分出次級血管圍繞腦室,甚至再向遠側的軟腦膜延伸。在向心與離心的血管之間造成一個灌流勉強足夠的區域(marginally perfused border zone)或稱分水嶺(watershed)。此區對周產期缺血(perinatal ischenria)最為敏感,這就是腦性痲痺(cerebral palsy)之病灶所在。

  到了成人期,人類腦部循環之血流量達50ml/100g/min。它佔心博輸出的20%,是一般器官單位重量血流的10倍。腦循環的另一特色為其微血管層面的blood brain barrier (BBB)。這是由內皮細胞的tight junction連結而成,阻礙了許多種分子由血液進入中樞神經。BBB在許多疾病狀態發生缺損,例如stroke或腦瘤,進而導致腦水腫,腦壓升高甚至死亡。

  諸多血管新生因子中,最受注目的應屬VEGF,VEGF在腦部廣泛表現。它可由缺氧,經轉錄因子HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1)誘發。有趣的是,去除腦部HIF-1的小鼠,VEGF的表現依舊而大範圍缺血的傷害仍可獲改善。中樞神經系統內VEGF訊息傳遞網絡的tyrosine kinase receptorS及下游的protein kinases與其他器官相彷,包括了VEGFR-2,某些情況還有VEFGR-1, MAPKs, PI3K/Akt以及Rho/Rac。


腦疾病的血管新生

  中樞神經的血管新生,在發育過程最為清楚,但亦可見於組織移植(tissue graft)及腫瘤生長(tumor growth)。神經組織移植於腦部之後,就會長出血管,其血管來源及生長過程依植入者為固態組織或離散細胞,位置在腦室或腦組織,是異種或同種移植而異。腦腫瘤的血管新生現象顯示,成人腦部能夠產生新血管,但這些血管缺乏BBB,以致造成腦水腫並且易於出血。不過這些新生血管也許可以成為抗血管療法(antiangio genesis)的治療標的。

  缺氧或缺血在多數組織可以引發血管新生,CNS也不例外。在成人腦部,純粹的缺氧較為罕見,但缺血則多有所在。一過性的大範圍腦缺血,例如心跳停止,導致許多脆弱的神經細胞死亡,海馬迴的CA1區域以及腦部或脊髓的分水嶺區域最為脆弱。更常見的是局部性缺血,造成局部組織死亡,引發中風。若血流在30分鐘內迅速恢復,則為TIA (transient ischemic attack)不致造成永久性的傷害。事實上,一過性的缺血可能有助於維護腦部免受下次缺血的傷害,此謂ischemic tolerance或pre-conditioning。

  解剖研究顯示腦缺血會刺激血管新生。腦中風的動物模式顯示血管新生現象在中風發生後1-2星期明顯可見。血管新生的現象在邊緣缺血區(ischemic penumbra)最為明顯。此區血流減少,但非完全斷絕。在此區血流的些微差異就足以決定細胞存活與否。實驗顯示,盡力讓此區細胞存活可以有助於復原。不過目前,缺血導致的血管新生在臨床上的影響如何,尚無新知。

  在大鼠,以VEGF增加血管新生可以減輕神經病變。這種治療策略也許臨床上有用,不過新生血管的滲漏性可能導致腦水腫。在VEGF之外,併用angiopoietin或HIF prolyl hydroxylase inhibitor可能有助於減少新生血管之滲漏。不過此一血管新生過程通常需要幾天,可能緩不濟急,因為神經細胞在缺血數分鐘之後就開始死亡。倒是對可以預測或再發性的中風,血管新生療法可能有其發揮功能之處。目前為止,VEGF在臨床上用於治療心臟及肢體的缺血,並無確實療效。VEGF在腦部缺血的臨床效果如何仍屬未知。在動物中風模式中,在1小時內給予VEGF,因增加腦水腫,故效果不佳,但48小時後給予,則有助於病情。看來,VEGF給予的時間點至為重要。

  某些腦疾病會導致出血,而非缺血,例如berry aneurysm會引起蜘蛛膜下出血,而vascular malformation則會導致腦組織的出血。大部分的情況其機制並不清楚,不過目前已知有兩種遺傳情況,包括hereditary hemorrhagic telangiectasia或Osler-Rendu-Weber disease以及部分KRIT1基因突變者的cerebral cavernous malformation。前者由endoglin基因的突變所致。Endoglin是內皮細胞上的homodimeric membrane glycoprotein,缺氧或缺血會引發endoglin的表現,因此可能與缺血導致的血管新生有關,但為何endoglin基因的突變會造成脆又薄的血管,易於出血,則未可知。


成人的神經細胞生成(neurogenesis)

  成人組織也需要細胞新生來應付細胞老化或死亡。成人組織均具有adult或tissue stem cell。這些幹細胞能自我更生(self-renewal)但卻非全能性(totipotant),一般只能產生某一特別組織或器官中特定的細胞。在細胞快速淘換的成人組織中,如骨髓、小腸、皮膚,此一現象最為明顯,腦組織亦然。

  腦的細胞再生至少見於下列二處:1. Subventricular zone (SVZ):在側腦室的邊壁之中;2. Subgranular zone (SGZ):位於hippoccampal dentate gyrus。在這些區域中,神經細胞的新生可以藉由BrdU標定及某些神經細胞標幟如double cortin (Dox)的表現來確認。在鼠類,SVZ產生的神經細胞會沿著rostral migratory stream抵達olfactory bulb,以補充因programmed cell death而減少的interneuron。在人類,SVZ所新生的神經細胞,其最終去向仍然不明。在dentate gyrus的SGZ所產生的神經細胞則進入附近的dentate granule cell layer,變成成熟且具有功能的granule neurons,它們可能參與記憶和學習。

  癲癇或腦部缺血所致的腦傷害會刺激神經細胞生成並使新生細胞移動到受創區域,可能藉此進行修復。在Huntington disease, Alzheimer disease及其動物模式均有神經細胞生成增加的證據。Liu等人最近報告,在amytorphic lateral sclerosis (ALS)的小鼠轉殖模式,脊髓的神經細胞新生增加,而神經細胞的前身細胞從central spinal canal遷移到ventral horn區域motor neuron死亡之處。看來,CNS會增加神經細胞新生並將之導引到受傷地區似乎在前述幾種疾病都可以發現。此一現象也許可以做為修復受損CNS的線索。

  不少生長因子均能促進神經細胞新生,包括FGF-2, EGF, BDNF (brain-derived neutrotrophic factor), erythropoietin, heparin-binding EGF like growth factor以及VEGF。在小鼠腦皮質體外培養以及成鼠活體的SVZ和SGZ之中, VEGF可以增進BrdU進入表現未成熟神經細胞標幟的細胞。VEGFR-2參與這些過程。不過,VEGF對astrocyte的生長促進似乎是透過活化VEGFR-1。看來,生長因子似乎可以用於治療性神經細胞新生,尤其若能透過非侵入性給予方式,例如經由鼻子。此舉並可避免腦以外的副作用。不過,對不同的情況可能需要不同的生長因子,例如VEGF能夠促進angiogenesis以及neurogenesis,因此也許可以用於中風,而不適合退化性疾病。

  成人的腦細胞新生仍然撲朔迷離,特別是VEGF引發成人細胞新生的現象仍難瞭解。環境強化(euvironmental enrichment)及學習經驗會引發海馬迴的神經細胞生成。大鼠若成長在身體接受環境強化或在Morris water maze接受訓練,其海馬迴VEGF的表現會增加。若藉由腦內注射表現VEGF的AAV vector以增加海馬迴VEGF的表現,則hippocampus-dependant的associate及spatial learning均有所增進。此一現象與VEGFR-2有關。相反地,若使用RNAi來減損hippocamgus中VEGF的表現,則可以抵消環境強化所致的神經細胞生成。


神經保護(neuroprotection )及神經再生(neuroregeneration)

  文獻上,VEGF在神經系統的相關報告是以其neurotrophic effect著稱。Sondell等人報告,在培養的Superior cervical及dorsal route ganglion neurons,VEGF會促進軸突生長及細胞存活,而此作用係經由VEGFR-2相關的機制。Silverman等人則報告,VEGF能改善organotypic midbrain explant culture的神經細胞存活。 後續的研究指出,VEGF能引起培養的神經細胞或cortical explant的神經突觸在數目上及長度上的增加。此一作用涉及VEGFR2,MAPK及PI3K/Akt之訊息傳遞。Rho/Rac訊息傳遞也可能與VEGF引起的突觸生長有關。

  除了這些促進生長的效果之外,VEGF也能保護神經細胞免於某些傷害,例如VEGF可以減少immortalized hippocampal neuron遭受serum withdrawal或缺氧後的死亡。此一作用係經由活化VEGF-2,PI3K/Akt及NK-Kb。VEGF也可以藉由類似的機制保護缺氧後之大腦皮質細胞培養,此外,caspase-3活化之降低可能也在其中扮演某些角色。VEGF可以保護培養的hippocampal neurons免於glutamate及N-methyl-D-aspartate之毒性。

  VEGF可以改變急性和慢性的神經退化過程。此作用可能是經由VEGF對血管、神經細胞,其至包括膠細胞的作用。大腦缺血會刺激VEGF的表現,藉此刺激大腦的神經細胞生成。局部使用VEGF可以減少brain infarct的大小,而VEGF靜脈注射會改進缺血引起的神經症狀。相反地,靜脈注射VEGF的抗體則會增加infarct的大小。有人經腹腔注射會吸附VEGF的fusion protein卻反而會減小infarct之大小。這顯示VEGF對腦缺血的影響並非全為正面。

  在大鼠之中腦動脈阻斷後1-3天將VEGF注入側腦室,會縮小缺血區之大小,且神經學變化較輕微。此效果在第三天最為顯著。相較之下,神經細胞的生成是在3-28天並進而刺激血管生成。因此VEGF可以在急性期發揮神經保護作用,但神經細胞生成及血管新生似乎與長期之復原有關,VEGF似乎對腦缺血亦有保護作用。

  VEGF與退化性腦疾病可能也有關連。Kalaria等人報告,Alzheimer disease患者腦中之反應性astrocyte團塊對VEGF得免疫反應增加。VEGF基因promoter區之SNP與發生Alzheimer disease的風險似乎有關連。

  在周邊神經方面,VEGF亦有其角色。肌肉注射encoding VEGF之plasmid DNA可以改進大鼠之糖尿病神經病變(以streptozotocin引發者)。另外肌肉注射naked VEGF DNA對兔子之缺血性神經病變也有類似效果。最令人期待的莫過於VEGF與ALS的關連。ALS引起脊髓與腦幹lower motor neuron以及運動皮質upper motor neuron的喪失。ALS大部分為偶發性,少部份可見基因突變。Carmeliet等發現VEGF基因中與hypoxia-responsive有關序列的突變會引起肢體無力,神經性肌肉萎縮,以及脊髓及腦幹之motor neuron喪失。VEGF可以增進培養的脊髓motor neuron之存活,包括wild type及VEGF 8/8小鼠。此一保護作用係經由VEGFR-2媒介,而且有一個neuropilin 1 co-receptor參與。

  在人類中,某些會減低血液中VEGF含量的遺傳變化會增加ALS之風險。在表現人類ALS突變基因的轉殖鼠,其病情可藉由腹腔或肌肉注射VEGF而減輕。另外藉由可以上溯至motor neuron的VEGF-expressing lentiviral vector之肌肉注射也有同樣療效。這些結果顯示VEGF對神經組織的基因治療頗有厚望。

  VEGF對其他的motor neuron disease可能亦有療效,包括X-linked spinal and bulbar muscular atrophy (Kennedy’s disease)以及與androgen receptor expansion有關的肌肉萎縮。後者可能干擾與CREB-binding protein有關的轉錄工作,而此一蛋白質正是VEGF基因的調控者。總之,VEGF已知與在遺傳型與表現型均各有特色的兩種motor neuron disease有關。

結論

  綜合上述的種種研究,在運用血管生成治療神經疾病方面可以有二個途徑:

1.利用VEGF來revascularize缺血的腦組織

2.利用VEGF之neuroprotective及neuroregenerative功能

前者對中風後再發性高的病患可能有用,例如中風後有25%的病人在3年內會再發,急性心肌梗塞後亦是中風好發的情況。因此,對這些病人可以考慮使用VEGF來預防中風。至於後者,也許可以應用於ALS, diabetic neuropathy………..。不過VEGF 對神經疾病真正療效如何,仍待觀察。


取材文獻

Greenberg DA et al: From angiogenesis to neuropathology.

Nature 438:954,15 December,2005

轉載自: [謝豐舟教授隨筆]

  

2008-11-24

[文摘] 為什麼我們老是忘東忘西?

都說腦子裡可以儲存大量的記憶,但為什麼需要它們時卻又找不著?一項新的研究為您解答

Edward K. Vogel及Trafton Drew 撰,吳佩玲 譯,Fan-Lu Kung 校

我們的腦子裡塞滿了平生累積的大量記憶。這些記憶有的深奧(我是誰?我怎樣來到世上的?),有的瑣碎不起眼(等紅燈的車子的車牌號碼)。此外,我們的記憶也時而精確,時而不精確。舉例來說,當過父母的人一定知道,為孩子挑選生日禮物時,要是記憶模糊不清會有多危險:爸媽送的G.I. Joe人偶有沒有功夫抓拳,可能會左右兒子收禮的心情。所以,在日常生活中,保持清晰的記憶,其重要性不亞於最初就記住大量資訊的能力。

不同類型記憶的精細度亦有差別?

過去數十年來,認知心理學家一直認定人類心智的記憶系統主要有兩種:一種是短期記憶(或稱工作記憶),暫時記下人們當下思考幾件事物的相關資訊;另一種則是長期記憶,保存人們畢生思考和經驗中所獲得的大量資訊。專家們認為,這兩種記憶系統的精細度亦有所不同:工作記憶提供的是此刻正思考的少數幾件事物清晰鮮明的細節,而長期記憶則像是過去曾見過、經歷過的諸多不同事物的一幅模模糊糊的圖像。也就是說,即使長期記憶中留有許多事物的資訊,但是它們的細節部分卻並不一定非常清晰,留下的往往只是我們所見、或者是事情發生經過的一些概括印象。

然而,一篇剛由麻省理工學院認知神經學者Timothy F. Brady與同僚共同發表的研究報告卻指出,這些長期記憶也許並不如以往學界所想像地那般模糊不清。在這個研究中,他們要求受試者試著記下三千張常見物品的圖片(包括背包、遙控器和烤麵包機等),受試者每次只會見到單張圖片,每張圖片只停留數秒。所有圖片放映完畢後,研究人員對受試者同時展示兩樣物品,並要他們從中指出曾經看過哪一樣的圖片,好測試受試者對每張圖片的記憶程度。試驗的結果並不令人意外,受試者的表現非常優異;即使要記下多達數千個物品,他們的答對率依然超過90%。這樣的結果證實,長期記憶有大量儲存訊息的能力。然而,令人最感訝異的是這些記憶的精密程度。即便兩張圖片顯示的是同一個物品,只在小地方有些微差異(比如烤麵包機中的麵包片有一點點不同),受試者依舊可以辨別出來。

如果記憶不模糊,為什麼我們還是忘東忘西?

這篇研究報告的證據顯示,人們長期記憶中龐大的資訊其實一點也不含糊。看樣子我們確實能將所見事物之表徵以頗為詳細、精確的形式記憶下來。

當然,這個新發現也引發一個明顯的問題:如果人類的記憶並沒有那麼模糊,那為什麼我們還是經常忘記那些想記得的細節?有種可能的解釋:儘管腦中確實容納了很多和不同事件、不同物品的表徵相關的細節,但並不代表當我們想利用某一項資訊時,每回都找得到它。就如同這篇研究所揭示,當我們眼前出現一個物品時,我們往往能夠正確而精準地判斷過去是否曾見過它。然而,當我們身處在玩具店中,試圖回想究竟兒子想要哪個生日禮物時,我們就得在沒有視覺刺激提醒的情況下,自發地在記憶中搜尋正確的答案。或許真正容易受到干擾和遺忘的,其實是這種主動搜尋的機制吧!至少,在拎著沒有功夫抓拳的G.I. Joe回家時,我們是這麼和小孩說的。

原文出處: Scientific American, November 4, 2008
http://www.sciam.com/article.cfm?id=why-do-we-forget-things

2008-11-13

[影片] 簡介「RNA干擾」現象之短片

lavande 譯



When long double-stranded RNAs were injected into a worms’ gonad, a standard way of introducing transgenes into worms, they blocked the expression of endogenous genes in a sequence-specific manner.

In eukaryotes, most protein-coding genes are transcribed by RNA polymerase II, which generates pre-mRNAs that are then processed to form mature mRNAs. These mRNAs are then transported from the nucleus to the cytoplasm, where they are translated. 

RNAi is a recently discovered process that can regulate endogenous gene expression. In plants, RNAi can be set in motion by genomically encoded short regulatory RNAs known as micro-RNAs. In algae, worms, and flies, RNAi can be activated by endogenous transposition. In plants and cultured insect cells, RNAi also has a role in anti-viral defense, in which viral double-stranded RNAs are targeted for destruction by the RNAi machinery.

When long double-stranded RNAs enter a cell, they are recognized and cleaved by Dicer, which is a member of the RNase III family of double-stranded RNA-specific endonucleases. Cleavage by Dicer creates short double-stranded RNAs that are characterized by two nucleotide long, 3’ overhangs. These are called small-interfering, or siRNAs. In worms, flies and mammals, siRNAs can form a ribonucleic protein complex called RISC, or RNAi silencing complex. This complex includes an unidentified nuclease that has been nicknamed Slicer.

A single-stranded siRNA that is coupled to RISC then binds to a target mRNA in a sequence-specific manner. This binding mediates target mRNA cleavage by Slicer. The site of cleavage falls in the middle of the region of siRNA complementarity. The cleaved mRNA can be recognized by the cell as being aberrant, and then destroyed.  This prevents translation from occurring, silencing the expression of the gene from which the mRNA was transcribed.

In plants, the aberrant RNA that result from RISC-mediated cleavage can also serve as a template for RNA-dependent RNA polymerase, or RdRp, to make a new double-stranded RNA molecule. This process relies on unprimed RNA synthesis, in which the aberrant RNA is used as a template. The resulting double-stranded RNA is a substrate for Dicer activity, which generates more siRNAs.

In some organisms with endogenous RNAi mechanisms, for example, fungi, plants, worms, and mammals, RNAi also involves another amplification step. In this step, single-stranded siRNAs not associated with RISC bind to their target mRNAs in a sequence-specific way, and serve as a primer for RdRp to polymerize the antisense RNA strand. Such specificity is intrinsically sensitive to natural sequence variation. The double-stranded RNA molecule that is created serves as a substrate for Dicer, which cuts it into siRNAs.

In turn, these siRNAs can either unwind and prime RNA-dependent RNA polymerization, or together with RISC mediates the cleavage of target mRNAs. This amplification, coupled with RNAi spreading between cells through an unknown mechanism, is thought to underlie germ line transmission of RNAi in worms.

「RNA干擾」現象首度於線蟲中發現。研究人員將長段的雙股RNA注射到線蟲生殖腺中(這是一種將基因引入線蟲常用的方式),發現這些RNA會阻撓線蟲內源性基因之表現,而受影響基因的序列恰與RNA序列互補。

在真核生物中,蛋白質的生成方式大概是這樣子的:第二型RNA聚合酶以蛋白質表達基因為模板,轉錄製造出pre-mRNA。pre-mRNA會進一步被修飾成成熟的mRNA,而後自細胞核內被運送出去,在細胞質中被轉譯製造出蛋白質。

近幾年才被發現的RNA干擾現象是生物調節體內基因表現的一種機制。植物基因組能製作出一種短小的調節性RNA(名為micro-RNA),用以啟動RNA干擾機制。在藻類、線蟲、果蠅中,RNA干擾現象也可能由基因轉位作用所活化。另外在植物和人工培養的昆蟲細胞中,干擾性RNA亦能破壞外來病毒的雙股RNA,發揮抗病毒之效用。

當長段雙股RNA進入細胞後,會被一種名為Dicer的雙股RNA內切酶(屬於第三類RNA水解酶)所辨識和切割。Dicer切割後會產生一類在3’端有2個核苷酸突出之小段雙股RNA,即siRNA,意為「小片段的干擾RNA」。在線蟲、果蠅和哺乳類中,siRNA能與其他蛋白質組合成為一核酸蛋白複合體,名為RISC,意為「能沉默基因之RNA干擾複合體」。此複合體中包含一個核酸內切酶,其身份尚未確知,研究人員暱稱它為Slicer。

接著,與RISC複合體連結在一起的單股siRNA會和序列互補之mRNA相互結合,Slicer進一步在兩者序列互補區段之中心點切割此mRNA。斷裂的mRNA會被細胞認定為異常物質而被摧毀,後續轉譯步驟無從進行,自然阻斷了mRNA上所載基因之表現,達到基因沉默之效。

在植物中,RISC切割後所產生的異常RNA還可作為RNA聚合酶合成RNA時的模板,在沒有引子的情況下製造出新的雙股RNA。這些雙股RNA又可被Dicer切割,進而產生更多siRNA。

而在藻類、植物、線蟲和哺乳類等體內具備RNA干擾機制的生物中,RNA干擾現象還可透過另一種方式擴大其效應。方法是這樣的:未與RISC複合體連結的單股siRNA與序列互補之mRNA結合後,可作為RNA聚合酶合成RNA時的引子,進而製造出反股RNA。(siRNA與mRNA的結合具有高度的序列專一性,如果其中之一的序列自然發生變化,這樣的結合就不會發生。)同樣地,這些雙股RNA又可被Dicer切割,進而產生出更多siRNA。

之後,新的siRNA或可鬆開成為單股RNA,作為引子導引RNA聚合反應的進行;或與RISC複合體聯手切割目標mRNA。學者們推測,正因為RNA干擾現象存有此擴增機制,以及另一種能於細胞間傳遞的不明機制,蟲類才得以將RNA干擾的特徵傳遞給子代。

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